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分享|基因编辑技术展望时间:2018-12-07

2018 年10月10日,CRISPR Therapeutics 于官网发布新闻:CRISPR Therapeutics与Vertex联合宣布:美国食品和药物管理局已解除针对镰状细胞病(SickleCell Disease)实验性基因编辑疗法CTX001 的临床限制。

据CRISPR Therapeutics 官网介绍:2017 年12 月7 日,公司已在除美国之外的其他国家获得CTA 批准(CTA 即临床试验申请;在美国和中国,“临床试验申请”一般被简称为IND)。

图 1: 公司 CRISPR 疗法已作为首例临床试验获得 CTA 批准

1.CRISPR 是一种基因编辑技术

CRISPR 又称为CRISPR/Cas 系统,这是一种 RNA-蛋白质的复合体,可用于基因编辑。CRISPR-Cas9 系统是存在于细菌和古生菌中的一种免疫机制。该机制可有效帮助菌体抵御包括噬菌体和质粒在内的一系列外源性 DNA 侵染,具有在特定位点高效、准确切割裂解外源DNA 的特点,近年来受到很多研究人员的关注,并被大量用于对真核细胞的基因编辑。CRISPR 的作用机制:CRISPR/Cas 系统由 CRISPR 和 Cas 核酸酶组成。CRISPR(全称为clustered regularly interspaced short palindromic repeats )是成簇的规律性间隔的短回文重复序列,该序列的前导区负责启动转录开始并合成前CRISPR-RNA(该段序列负责与DNA 配对,并提供模版)。现在的基因工程中常用的 Cas 核酸酶是 Cas9 核酸酶(该酶负责切割DNA)。Cas9 酶有 2 个重要的核酸酶结构域,分别是 RuvC 和 HNH 结构域(可以类比理解为一种识别工具)。HNH 结构域负责断裂通过互补靶向的DNA 单链,切割位点位于 PAM 序列(可以类比理解为一种标记物)上游 3 个碱基(基因的组成单位)处。CRISPR/Cas 基因编辑工具在应用方面也具有一定的局限性,主要是 PAM 序列的依赖性与脱靶效应。

根据核心蛋白元件以及用途的不同,目前CRISPR系统可分为2大类、6小类,共19个亚型,其中研究最多、进展最快、应用最广的是第二大类中的II型(CRISPR/Cas9)和V型(CRISPR/Cpf1),用于DNA的基因编辑。与CRISPR/Cas9系统相比,CRISPR/Cpf1系统具有多方面的优势:(1)系统结构更简单:Cpf1蛋白在功能上比Cas9蛋白更集成,分子量也更小,更容易进入细胞,提高基因编辑效率;同时Cpf1蛋白只需要一个RNA分子协助(Cas9至少需要2个);(2)DNA剪切方式更优:Cpf1蛋白剪切DNA后会产生黏性末端,便于新DNA序列插入;(3)DNA剪切位置不同:Cpf1蛋白在DNA上的剪切位点离识别位点很远,可编辑位置的选择余地更大;(4)Cpf1蛋白不同的识别序列令其基因编辑效果更好;(5)CRISPR/Cas9有一定的脱靶率,而CRISPR/Cpf1几乎不脱靶;(6)Cpf1在多基因编辑上更有优势。

CRISPR系统的优势主要体现在系统设计简便、可实现多基因编辑等。

系统设计简便、易于操作:以CRISPR/Cas9为例,发挥DNA剪切功能的Cas9元件是通用的,因此只需要根据靶基因的不同设计相应的gRNA即可,其设计难度和复杂度远低于ZFN和TALEN,大大拓展了CRISPR系统的应用前景。

此外,CRISPR还具有基因编辑效率更高、脱靶风险低、操作成本低等多方面的优势。然而,CRISPR技术出现时间还太短,科学家还无法充分预估其潜在风险。

可能因人体免疫反应而失效:2018年1月,斯坦福大学儿科血液学家Matthew Porteus和Kenneth Weinberg领导的研究小组发表论文,发现在70%的人中都发现了Cas9同源蛋白的抗体,而超过一半的人都存在其同源物的抗原特异性T细胞,这意味着CRISPR/Cas9系统进入人体后可能被人体自身的免疫系统清除而失效,甚至有可能会引发人体剧烈的免疫反应。至于人体自带Cas9抗体的原因,科学家推测Cas9蛋白来源于细菌,可能在人类进化过程中产生了相应的抗体作为保护机制。因此,要解决这个问题,可能需要对Cas9蛋白进行修饰而避免人体的免疫反应,或者从不存在于人体的微生物中继续寻找其他代替Cas9的酶。另一方面,也有不少科学家对论文结论的可靠性提出了质疑,CRISPR/Cas9的结局如何还需要等待科学界最后的评判。

仍可能存在脱靶风险:CRISPR/Cpf1虽然相对于CRISPR/Cas9在脱靶的问题上已经有了明显的改善,但仍不可避免地存在未知的脱靶风险,相关技术的安全性也需要进一步考察。

1.1 镰状细胞病是一种常染色体显性遗传疾病

镰状细胞病(Sickle Cell disease.SCD)又称镰状细胞贫血,是一种常染色体显性遗传血红蛋

白(Hb)病。正常成人血红蛋白是由两条α链和两条β链相互结合成的四聚体,α链和β链分别由141 和146 个氨基酸顺序连结构成。镰状细胞贫血患者因β链第6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替(谷氨酸与缬氨酸对应的密码子仅有1~2 个碱基的差异),形成了异常的血红蛋白S(hemoglobin S,HbS),取代了正常血红蛋白(HbA)。

镰状细胞贫血症患者在出生时就带有β球蛋白基因突变,这种基因突变导致了骨髓生成的血液干细胞产生出像新月或镰刀样的红细胞。这种异常形状的红细胞不能在血管中顺畅的流动,因此不能有效给重要的器官提供氧气。临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以致慢性局部缺血导致器官组织损害。

《中国小儿血液》报道:1975 年曾在我国广东佛山地区发现 1 例镰状细胞地贫患者,其家族中又发现 2 例镰特患者,均为非洲血统的混血儿。故随着异国婚配增多,镰状细胞病的发病率随之增加。《实用儿科临床杂志》曾于1989 年登载中国援赞医疗队文章:非洲热带地区黑人种族中流行着一种很常见的遗传性疾病——镰刀状细胞性贫血。

2016 年《自然》报道:美国斯坦福大学医学院的研究人员的临床前实验揭示在细胞层面上使用CRISPR/Cas基因编辑技术能修复突变。但是人体临床试验情况未知。据《自然》报道:

镰状细胞疾病影响7万到10 万美国人,在全球影响上百万人。

目前镰刀型细胞贫血尚无法治愈,临床上采用的治疗方案多只能缓解症状,如输血、造血干细胞移植等,而基因治疗有望对镰刀型细胞贫血进行根治。不同于地中海贫血转基因的治疗方案,镰刀型细胞贫血需要对患者自身错误的基因进行纠正,故而在采集病人的造血干细胞后,可利用基因编辑技术,把突变的基因变回正常的基因,使造血干细胞的功能得到恢复,再将改造后的造血干细胞回输给病人,实现疾病的治疗


1.2地中海贫血:基因治疗有望颠覆现有治疗方案

地中海贫血即珠蛋白生成障碍性贫血,患者通常表现出常见的贫血状态以及相应的并发症,其致病机制是珠蛋白基因缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成,导致血红蛋白的组成成分改变,进而引发红细胞寿命缩短,表现为慢性溶血性贫血。地中海贫血属于常染色体隐性基因遗传病,当夫妻双方均为致病基因的携带者时,其后代有25%的概率会患病,50%的概率为致病基因携带者,25%的概率基因完全正常。

针对地中海贫血,目前临床上常规的治疗方案是定期输血,患者需要终身治疗,治疗费用昂贵,且容易产生输血副反应;根治方案是进行造血干细胞移植,将健康人的造血干细胞植入病人体内,可实现疾病的治愈,但最大的障碍是造血干细胞配型非常困难,即使配型成功,多数病人接受治疗后仍需长期服用免疫抑制性药物。最有前景的治疗方案是基因治疗,从病人的外周血中收集造血干细胞后,利用病毒载体将正常的珠蛋白基因导入其中,使细胞功能恢复正常,再将改造后的造血干细胞回输给病人。造血干细胞来源于病人自身,因此不存在配型和排斥的问题。改造的造血干细胞进入病人体内后,会源源不断地产生功能正常的新的红细胞,从而达到缓解甚至治愈疾病的目的。综合比较,目前临床上地中海贫血的治疗方案都存在诸多缺陷,而基因治疗则在很大程度上填补了这个临床未满足需求,待技术进一步成熟后,有望在临床上迅速得到推广,进而取代目前并不完美的治疗方案。

1.3血友病:基因治疗让“外伤出血”不再可怕

常见的血友病(A型和B型血友病)是X染色体连锁的隐性基因遗传病。患者因凝血因子基因缺陷导致凝血功能障碍,临床表现为终身轻微外伤即发生长时间出血。凝血因子有很多种,每种凝血因子均在凝血的过程中发挥重要作用,不同凝血因子基因的缺陷会产生不同类型的血友病,临床均表现为凝血障碍。

目前临床上血友病的治疗方案主要是替代治疗,即给患者注射其血液中缺少的凝血因子。这种治疗方案的缺陷很明显,不能治愈、需要终身治疗,治疗费用非常昂贵。基因治疗的思路非常明确——缺啥补啥,只需要利用转基因的方式给患者自身的细胞补充其缺失的凝血因子基因即可。凝血因子主要由肝细胞产生,因此血友病基因治疗的操作对象是患者的肝细胞。不同于地中海贫血和镰刀型细胞贫血的治疗,“离体”基因治疗方案在血友病中行不通,只能采取体内治疗的方式。通过原位注射将携带正常基因的病毒载体注入肝组织中,病毒载体再把正常基因导入肝细胞,实现基因的补偿,治愈血友病。

1.4溶瘤病毒:从“恶魔”到“天使”的华丽变身

溶瘤病毒是基因治疗在肿瘤治疗上的另一个应用。通过基因改造,科学家赋予了传统病毒全新的功能:(1)溶瘤病毒感染肿瘤细胞后能大量增殖并使肿瘤细胞发生裂解,但在正常细胞中溶瘤病毒的增殖受到限制,降低了副作用;(2)改造后的溶瘤病毒携带某些能抑制肿瘤细胞分裂的基因,当病毒感染肿瘤细胞后会抑制肿瘤细胞增殖,从而实现肿瘤的控制;(3)某些改造后的溶瘤病毒具有肿瘤细胞靶向性,进一步提高了肿瘤杀伤效果,降低了副作用。溶瘤病毒是目前众多肿瘤治疗方案的一部分,技术成熟后有望单独使用或和其他治疗方案联合使用,提高肿瘤的可治愈性。

1.5艾滋病:从偶然医疗事件到基因治疗

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征,由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起。HIV进入人体后,主要攻击CD4阳性的T淋巴细胞,破坏人体的免疫系统,最终患者多因免疫系统崩溃而罹患肿瘤或受其他病原体感染致死。研究发现,HIV感染T细胞需要由细胞表面的多种蛋白共同介导,因此阻断这些蛋白与HIV的识别有望治愈艾滋病。

学家曾偶然发现一名艾滋病患者在接受骨髓移植后其体内的HIV消失了,这意味着这名患者的艾滋病被骨髓移植治愈了。进一步研究发现,其骨髓捐献者天然携带CCR5△32这种基因变异,而该基因原型CCR5是介导HIV感染T细胞的关键蛋白之一,这种基因突变阻断了HIV感染T细胞的途径,使T细胞获得了抵抗HIV的特殊能力。因此,通过基因编辑的方式,将患者造血干细胞的CCR5基因替换成CCR5△32,即可使患者新生成的T细胞获得抵抗HIV的能力,再辅以抗病毒药物的治疗,有望实现艾滋病的治愈。该技术成熟以后,将彻底终结目前“谈艾色变”的局面。

随着近期基因编辑婴儿的出生,基因编辑引起人们的广泛关注,作为一名生物学者,我们强烈谴责这种违背伦理道德、号称拯救他人做法的试验的进行。我们鼓励科学实验创新,但严禁突破法律和伦理的底线,要敬畏生命、遵守规则、呵护健康、造福人类。


(本文转自生物制品圈)

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